產(chǎn)品中心
Cell-Free Protein Synthesis Kit (Kcr)
無細胞蛋白合成試劑盒（非天然氨基酸Kcr版）
- EG25332S
產(chǎn)品介紹
無細胞蛋白合成試劑盒是一款基于大腸桿菌細胞裂解液進行體外蛋白質(zhì)合成的產(chǎn)品。該產(chǎn)品為非天然氨基酸—Nε-crotonyl-L-lysine (Kcr) 款，能夠利用DNA序列中的琥珀終止密碼子TAG向目的序列中定向插入Kcr。試劑盒中包含非天然氨基酸Kcr、tRNA、氨酰tRNA合成酶三種額外成分，可根據(jù)客戶具體實驗進行添加量的優(yōu)化。
注：本貨號產(chǎn)品不適合可溶表達含二硫鍵的蛋白，不具備二硫鍵正確折疊的氧化環(huán)境；如需可溶表達含二硫鍵的蛋白，請聯(lián)系其他貨號。
產(chǎn)品組成
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組分 |
規(guī)格 |
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Cell-free system solution A |
300 μl |
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Cell-free system solution B |
400 μl |
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CFPS-Control Plasmid |
2 μg |
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Nε-crotonyl-L-lysine Kcr (25×) |
60 μl |
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tRNA（25×） |
60 μl |
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Aminoacyl-tRNA synthetase (50×) |
40 μl |
儲存條件
-80℃保存，有效期12個月。
干冰運輸。用戶開封后，將無細胞蛋白表達反應組分置于-80℃儲存。
為避免反復凍融，可根據(jù)反應用量，將A液和B液分別分裝后用液氮速凍后再置于-80℃儲存。
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相關(guān)問答
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Q:
使用本品表達其他蛋白，是不是根據(jù)提供的質(zhì)粒骨架進行替換 superfolder GFP 的CDS區(qū)域即可？
A:表達其他蛋白時，只替換superfolder GFP會殘留N端的標簽，如果不需要標簽替換從ATG到TAA整個翻譯區(qū)。
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Q:
質(zhì)粒骨架的 T7 啟動子→T7 終止子以外的質(zhì)粒骨架序列是否可以替換？還是必須用您這邊的骨架序列？
A:可以，例如pET9a、pET23a等質(zhì)粒也可以，重點是T7啟動子到T7終止子序列不建議替換，質(zhì)粒骨架可以換。
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Q:
T7 promoter后面到蛋白的CDS區(qū)域質(zhì)檢的 5’UTR序列是否是您這邊經(jīng)過優(yōu)化的？未進行標注的關(guān)鍵區(qū)域是否可以再進行序列優(yōu)化和替換？
A:5’UTR是優(yōu)化的，不建議替換。T7啟動子到T7終止子區(qū)域不建議替換，如果該區(qū)域有優(yōu)化需求可自行嘗試優(yōu)化，其它區(qū)域都可以優(yōu)化和替換。
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Q:
加入模板DNA的最低濃度是多少？是否DNA模板加入量和蛋白表達效率相關(guān)？
A:模板DNA濃度低于4 ng/μl，會降低表達量。模板DNA加入量和蛋白表達量有關(guān)，建議根據(jù)蛋白優(yōu)化，一般8 ng/μl左右就可以。
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Q:
相同模板的蛋白表達量組間差和批間差是否穩(wěn)定，是否有相關(guān)數(shù)據(jù)？
A:相同模板的蛋白表達量組間差和批次差相對穩(wěn)定，偏差約10%~20%左右。
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Q:
無細胞表達與傳統(tǒng)大腸桿菌表達的區(qū)別是什么？
A:對比項
無細胞表達系統(tǒng)
傳統(tǒng)細胞表達系統(tǒng)
定義
無細胞蛋白表達屬于體外反應系統(tǒng)，無需完整活細胞，直接利用細胞提取物（含核糖體、酶、tRNA、氨基酸等翻譯所需成分），在體外環(huán)境中完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。
傳統(tǒng)大腸桿菌表達依賴活的大腸桿菌細胞，通過將目的基因?qū)爰毎?，利用細胞自身的轉(zhuǎn)錄、翻譯機制（體內(nèi)環(huán)境）合成蛋白。
實驗流程
模版制備→無細胞反應
質(zhì)粒構(gòu)建→轉(zhuǎn)化大腸桿菌→篩選陽性克隆→擴大培養(yǎng)→誘導表達→收集細胞→裂解純化
耗費時間
1~2 h 即可表達出目的蛋白，8~16 h 即可達到最大量
時間數(shù)天到數(shù)周
特殊蛋白表達
可表達各種類型的蛋白，包括毒性蛋白、富含二硫鍵蛋白或難溶蛋白
毒性蛋白、富含二硫鍵蛋白或難溶蛋白表達困難
操作便捷性
簡單快捷，開蓋即用，僅需加入 DNA 或 RNA 模板
對實驗條件和操作技能要求高
應用靈活性
可使用 96 孔板或離心管進行反應，高通量篩選；修飾等更靈活
難以實現(xiàn)高通量表達和篩選
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Q:
合成的蛋白質(zhì)可以使用哪些方法純化？
A:可以使用鎳磁珠純化。
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Q:
是否需要在合成前純化質(zhì)?；蚓€性 DNA 模板？
A:說明DNA的質(zhì)量對無細胞很關(guān)鍵，可以使用高品質(zhì)的質(zhì)粒小量制備試劑盒或 PCR 和 DNA 純化試劑盒。
