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Cell-Free Protein Synthesis Kit (pAcF)
無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒（非天然氨基酸pAcF版）
- EG25330S
產(chǎn)品介紹
無(wú)細(xì)胞蛋白合成試劑盒是一款基于大腸桿菌細(xì)胞裂解液進(jìn)行體外蛋白質(zhì)合成的產(chǎn)品。該產(chǎn)品為非天然氨基酸—4-乙?；?L-苯丙氨酸（pAcF）款，能夠利用DNA序列中的琥珀終止密碼子TAG向目的序列中定向插入pAcF。試劑盒中包含非天然氨基酸pAcF、tRNA、氨酰tRNA合成酶三種額外成分，可根據(jù)客戶(hù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行添加量的優(yōu)化。
注：本貨號(hào)產(chǎn)品不適合可溶表達(dá)含二硫鍵的蛋白，不具備二硫鍵正確折疊的氧化環(huán)境；如需可溶表達(dá)含二硫鍵的蛋白，請(qǐng)聯(lián)系其他貨號(hào)。
產(chǎn)品組成
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組分 |
規(guī)格 |
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Cell-free system solution A |
300 μl |
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Cell-free system solution B |
400 μl |
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CFPS-Control Plasmid |
2 μg |
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Non-canonical amino acid pAcF (25×) |
60 μl |
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tRNA（25×） |
60 μl |
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Aminoacyl-tRNA synthetase (50×) |
40 μl |
儲(chǔ)運(yùn)條件
-80℃保存，有效期12個(gè)月。
干冰運(yùn)輸。用戶(hù)開(kāi)封后，將無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)反應(yīng)組分置于-80℃儲(chǔ)存。
為避免反復(fù)凍融，可根據(jù)反應(yīng)用量，將A液和B液分別分裝后用液氮速凍后再置于-80℃儲(chǔ)存。
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相關(guān)問(wèn)答
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Q:
使用本品表達(dá)其他蛋白，是不是根據(jù)提供的質(zhì)粒骨架進(jìn)行替換 superfolder GFP 的CDS區(qū)域即可？
A:表達(dá)其他蛋白時(shí)，只替換superfolder GFP會(huì)殘留N端的標(biāo)簽，如果不需要標(biāo)簽替換從ATG到TAA整個(gè)翻譯區(qū)。
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Q:
質(zhì)粒骨架的 T7 啟動(dòng)子→T7 終止子以外的質(zhì)粒骨架序列是否可以替換？還是必須用您這邊的骨架序列？
A:可以，例如pET9a、pET23a等質(zhì)粒也可以，重點(diǎn)是T7啟動(dòng)子到T7終止子序列不建議替換，質(zhì)粒骨架可以換。
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Q:
T7 promoter后面到蛋白的CDS區(qū)域質(zhì)檢的 5’UTR序列是否是您這邊經(jīng)過(guò)優(yōu)化的？未進(jìn)行標(biāo)注的關(guān)鍵區(qū)域是否可以再進(jìn)行序列優(yōu)化和替換？
A:5’UTR是優(yōu)化的，不建議替換。T7啟動(dòng)子到T7終止子區(qū)域不建議替換，如果該區(qū)域有優(yōu)化需求可自行嘗試優(yōu)化，其它區(qū)域都可以?xún)?yōu)化和替換。
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Q:
加入模板DNA的最低濃度是多少？是否DNA模板加入量和蛋白表達(dá)效率相關(guān)？
A:模板DNA濃度低于4 ng/μl，會(huì)降低表達(dá)量。模板DNA加入量和蛋白表達(dá)量有關(guān)，建議根據(jù)蛋白優(yōu)化，一般8 ng/μl左右就可以。
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Q:
相同模板的蛋白表達(dá)量組間差和批間差是否穩(wěn)定，是否有相關(guān)數(shù)據(jù)？
A:相同模板的蛋白表達(dá)量組間差和批次差相對(duì)穩(wěn)定，偏差約10%~20%左右。
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Q:
無(wú)細(xì)胞表達(dá)與傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)的區(qū)別是什么？
A:對(duì)比項(xiàng)
無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
定義
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)屬于體外反應(yīng)系統(tǒng)，無(wú)需完整活細(xì)胞，直接利用細(xì)胞提取物（含核糖體、酶、tRNA、氨基酸等翻譯所需成分），在體外環(huán)境中完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。
傳統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)依賴(lài)活的大腸桿菌細(xì)胞，通過(guò)將目的基因?qū)爰?xì)胞，利用細(xì)胞自身的轉(zhuǎn)錄、翻譯機(jī)制（體內(nèi)環(huán)境）合成蛋白。
實(shí)驗(yàn)流程
模版制備→無(wú)細(xì)胞反應(yīng)
質(zhì)粒構(gòu)建→轉(zhuǎn)化大腸桿菌→篩選陽(yáng)性克隆→擴(kuò)大培養(yǎng)→誘導(dǎo)表達(dá)→收集細(xì)胞→裂解純化
耗費(fèi)時(shí)間
1~2 h 即可表達(dá)出目的蛋白，8~16 h 即可達(dá)到最大量
時(shí)間數(shù)天到數(shù)周
特殊蛋白表達(dá)
可表達(dá)各種類(lèi)型的蛋白，包括毒性蛋白、富含二硫鍵蛋白或難溶蛋白
毒性蛋白、富含二硫鍵蛋白或難溶蛋白表達(dá)困難
操作便捷性
簡(jiǎn)單快捷，開(kāi)蓋即用，僅需加入 DNA 或 RNA 模板
對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作技能要求高
應(yīng)用靈活性
可使用 96 孔板或離心管進(jìn)行反應(yīng)，高通量篩選；修飾等更靈活
難以實(shí)現(xiàn)高通量表達(dá)和篩選
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Q:
合成的蛋白質(zhì)可以使用哪些方法純化？
A:可以使用鎳磁珠純化。
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Q:
是否需要在合成前純化質(zhì)?；蚓€(xiàn)性 DNA 模板？
A:說(shuō)明DNA的質(zhì)量對(duì)無(wú)細(xì)胞很關(guān)鍵，可以使用高品質(zhì)的質(zhì)粒小量制備試劑盒或 PCR 和 DNA 純化試劑盒。
